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红曲霉菌的研究概况与方向
   编辑:   浏览:3048  时间:2009-11-24 
 
红曲霉菌的研究概况与发展方向

一、 研究的目的和意义
    红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的伟大发明,称为丹曲,至今已有1000多年的历史,很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。明代《本草纲目》中记载:“红曲,性温、味甘,消食活血,健脾燥胃。酿酒,破血行药势。”红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面:食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素,具有热稳定性好,蛋白着色力强,色调柔和,可以提高加工制品对光和氧稳定等优点;而且红曲色素无毒性、无致突变作用,安全性很高,因此红曲可提供安全性高的天然色素。1979年,日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K后,人们开始对天然红曲及Monacolin类化合物给予了新的广泛关注。美国FDA于1987年正式批准美降脂药(洛伐他汀,即Monacolin K)用于临床。迄今为止,美国和日本等已开发出一系列他汀类药物如Lovastatin、Provastatin、Simvastatin和Atorvastatin等,其主要成分即为Monacolin类化合物。我国用红曲开发的降血脂药物及保健食品有血脂康、脂必妥和健心宝等。药理及临床实验显示,红曲不但有降血脂、降血压、降血糖功效,而且还有明显抑菌、增强免疫力、抗疲劳的作用。目前,世界各国均投入很大的人力及物力开展红曲的基础与应用研究。

    降脂红曲不但具有显著的血脂调节作用,而且其针对病因,疗效显著,毒副作用少,耐受性好,是长期以来寻找降血脂药物研究的一个突破性进展。功能红曲中起主要降脂作用的物质是洛伐他汀,它是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂,而HMG-CoA还原酶是控制胆固醇合成速度的关键酶,因此抑制这个酶的活性,就能减少或阻断体内胆固醇的合成。洛伐他汀有内酯式和β-羟基酸式两种结构。化学合成药洛伐他汀为内酯式,需在体内水解成相应的酸式而发挥药效,由于需要消耗体内的羟基酯酶,长期使用会增加肝肾负担,其常见副作用还有腹痛、腹泻、便秘、恶心、呕吐及消化不良等胃肠道症状。天然红曲中的洛伐他汀多为酸式,其空间结构与体内HMG-CoA更为接近,无需水解,直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用,其活性较内酯式高约一倍。洛伐他汀浓度只要达到0.001-0.005ug/mL,胆固醇的合成就会受阻。洛伐他汀是胞内产物,而且细胞内的积累速率基本上与生长同步,因此非常适合于采用固态发酵,这样不仅可大大降低生产成本,固态发酵产物无需提取,可直接作为原料开发功能性食品。红曲降脂功能食品的开发无异于为红曲的应用开辟了另一片天地,有效的避免了降脂药物的毒副作用。高脂血症是动脉粥样硬化、冠心病及脑血管病的主要危险因素,调节血脂水平对于防止心脏血管疾病中具有重要意义。据卫生部统计,我国35岁以上人群冠心病的发病率为3%-5%。目前,我国心脑血管病患者已超过1.8亿,患者人群已由50岁以上向30岁转移,每年死于心脑血管病人数己达300万以上,占所有疾病死亡人数的50%。具有发病率高、致残率高、死亡率及复发率高的特点,己成为危害人类健康的"头号杀手",随生活水平的提高,由高脂血症引发的各种疾病发病率将会明显上升。因此加强对高脂血症的早期治疗,做好心脑血管疾病的预防,显得尤为重要。

    目前国内的功能性红曲生产菌株存在一些问题。首先,菌株普遍缺少安全性评价,据随机抽查结果,大部分红曲样品桔霉素含量超标(0.2 µg/g)。其次,菌株洛伐他汀产率偏低,且产品质量不稳定。桔霉素(Citritin)是由真菌产生的次级代谢产物,桔霉素亦是红曲菌产生的次级代谢产物之一,其LD50值为10~100 µg/ml,毒性与黄曲霉毒素B1相当,主要表现为肾毒性,可引起肾肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。桔霉素还可引起呕吐、腹泻、致畸、致癌和诱发基因突变等。桔霉素与红曲色素均可溶于有机溶剂,红曲色素提取工艺多采用有机溶剂提取,因此目前市面上绝大部分红曲色素都不同程度含有桔霉素。1981年香港中文大学Hinchung Wang等首次从红曲中分离到一种抑菌因子称之为Monascidin A(红曲杀菌物 A),1995年法国的Blank等从红曲中分离到同一物质,并证实了该物质为对人体有害的桔霉素。由于发现红曲产品中桔霉素的存在,欧美国家已制订出针对我国出口的红曲及相关产品的新标准,严格限制红曲及相关产品中桔霉素的含量。而目前我国的红曲产品中桔霉素的含量通常高于该规定值,如何减少红曲产品中桔霉素的含量,已经成为当前迫切需要解决的问题。此外,红曲色素的稳定性仍是制约红曲色素大量使用的一个因素。红曲的三种次级代谢物:红曲色素、洛伐他汀、桔霉素的生化合成都是通过聚酮体合成酶(PKS)合成的,在合成后期由不同的功能域作用,形成不同的结构。因此有必要对红曲霉菌的聚酮体合成酶(PKS)基因进行研究,在基因水平上对菌株进行定向突变,获得不合成桔霉素或桔霉素含量低于产品标准允许值的红曲产品,并提高菌株洛伐他仃的含量与红曲色素的稳定性。

二、国内外研究概况
    红曲霉(Monascus spp.)作为极具东方色彩的霉菌,在中国及其周边国家日本、韩国、新加坡、泰国等地,广泛地被应用于酿酒作醋、食品着色和作为中药使用。近年来,欧美等国的研究人员对红曲霉的研究兴趣不断增加。红曲色素应用领域的扩大,功能性红曲产品的开发利用,桔霉素的研究,新型培养技术的应用,使红曲的研究进入新的阶段。我国是红曲产品生产与应用的大国,在许多方面处于世界前列,但我们在新技术应用于红曲研究方面明显落伍,有些现实问题无法解决。如我国早就发现红曲具有降血脂的功能,但是日本研究人员发现降血脂的成分为洛伐他仃,而且我国对影响洛伐他仃,桔霉素,红曲色素产生的深入研究还明显不够,多处于跟踪研究。为了提高有应用价值的代谢产物如红曲色素和洛伐他仃的产量,提高原料转化率,同时减少或消除红曲产品中的桔霉素,世界各国均做了大量的研究工作。目前主要是通过菌种筛选,或在生物合成代谢途径的研究基础上,对发酵工艺进行控制来调节产物的合成。这显然是不够的,利用基因工程技术改造红曲霉菌种才能从根本上解决这些问题,这就需要对这些代谢物的合成基因(聚酮体合成酶基因,PKS)进行系统与深入的研究。西方国家在一些真菌的PKS领域进行了多年的基础理论研究,但对红曲霉的PKS很少有报道,GeneBank内很少搜索到红曲霉的PKS基因。但这只是一个时间问题,法国图卢兹国立科学应用学院2002年就在申请经费开展红曲霉的分子遗传学研究。美国California University of Los Angeles, Center for Dietary Supplements Research也将具有保健功能的中国红曲作为重点研究对象。我们开展这项研究工作,目的在于从红曲霉的基因水平上改造菌种,生产出高质量的药用和食用产品,并通过对红曲霉PKS基因的研究,获得基因专利,更好地保护和利用我国的微生物种质和基因资源。

下表为有关红曲中降低桔霉素含量的国际与国内专利:

申请人 申请日 专利号 题 目
BIOCOSMOS YG(日本) 1994.4.13 JP7274978-A 利用红曲霉突变株生产不含桔霉素食品添加剂红曲色素
NIHIRA T YAEGAKI HAKKO GIKEN KK (日本) 2004.2.26 JP2004321176 新的编码聚酮体合成酶的基因及其在构建不含桔霉素的红曲霉菌上的应用
江南大学 2003.4.30 CN1448503 一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法
中山大学 2003.7.10 CN1480526 一种不含桔霉素的功能性红曲菌生产方法
食品工业发展研究所(台湾) 2001.8.24 US6635467 红曲霉突变株及其在制备黄色色素上的应用
食品工业发展研究所(台湾) 2002.12.30 CN1511942 红曲霉突变株及其于制备具降血压活性发酵产物之用途
食品工业发展研究所(台湾) 2003.7.29 US2004047842 红曲霉突变株及其于制备具降血压活性发酵产物之用途
 

    红曲菌具有很强的产色素能力。红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素,其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin),橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin),紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系,结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。当色素加入食品中,由于受到加工、酸、碱、盐、光、热、氧化等作用,使其结构发生变化,如破坏原有共轭体系,改变共轭双键的数目,形成或损失助色团等情况,就会导致物质吸收光的波长发生变化,如在可见区域移动则使物质颜色变化;如移至远紫外区则使物质呈无色(即褪色)。 因此要获得适于实际应用的红曲色素需要了解其合成基因的结构与功能。

    国外研究者通过放射性标记、酶法与化学合成等手段的研究表明:红曲霉的红曲色素、桔霉素与洛伐他仃都是聚酮体化合物,是由聚酮体合成酶(PKS)催化合成的。聚酮体合成酶(PKS)是合成聚酮体化合物的关键酶,PKS的酶活性中心包括酰基转移酶,酮基合成酶,酰基转移蛋白,酮基还原酶,烯酰还原酶和脱水酶等。通过对土曲霉中与洛伐他仃合成有关的PKS基因簇的研究,获得一项基因专利(P99025 US),这个基因簇由5个基因组成,lovB、 lovC、 lovD、 lovE、 lovF,将lov E基因转化到土曲霉或其它产洛伐他仃的真菌,可使洛伐他仃的产量提高2—7倍。具有较高的经济价值。国外对PKS基因序列的分析,发现不同种类的生物,PKS基因序列有一定差异,但其主要功能域的序列是保守的。采用不同PKS基因的模块交换技术,人工组装不同模块的基因,可合成新的聚酮体化合物,研制通用引物或特殊的引物,可分离同源或异源的PKS基因,用已知基因序列做探针,可分离和鉴别其它的PKS基因。利用分子生物学技术研究红曲霉的PKS基因在技术上已不存在任何问题。我国具有丰富的红曲霉菌种资源,从中发现新的基因是完全可能的。但国内目前对于红曲霉PKS基因的研究仅处于起步阶段,与发达国家相比,差距较大。

三、东莞市天益生物工程有限公司的研究方向
    目前国内的红曲生产菌株存在一些问题。菌株普遍缺少安全性评价,据随机抽查结果,部分红曲样品桔霉素含量超标(0.2μg/g)。桔霉素是红曲菌产生的次级代谢产物之一,其LD50值为10~100μg/ml,毒性与黄曲霉毒素B1相当,主要表现为肾毒性,可引起肾肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。桔霉素还可以引起呕吐、腹泻、致畸、致癌和诱发基因突变等。桔霉素与红曲色素均可溶于有机溶剂,红曲色素提取工艺多采用有机溶剂提取,因此目前市面上绝大部分红曲色素都不同程度含有桔霉素。1981年香港中文大学Hinchung Wang等首次从红曲中分离到一种抑菌因子称之为Monascidin A(红曲杀菌物A)。1995年法国的Blank等从红曲中分离到同一物质,并证实了该物质为对人体有害的桔霉素。由于发现红曲产品中桔霉素的存在,欧美国家已制定出针对我国出口的红曲及相关产品的新标准,严格限制红曲及相关产品中的桔霉素含量。而目前我国的红曲产品中桔霉素的含量通常高于该规定值,如何减少红曲产品中桔霉素的含量,已经成为当前迫切需要解决的问题。此外,红曲色素的稳定性仍是制约红曲色素大量使用的一个因素。我公司从菌种分离筛选、工艺配方调整等进行了长期、大量的实验研究,取得了明显效果,桔霉素含量经权威部门检测,是国内唯一符合日本食品添加剂公定书标准要求的厂家。杨晓暾科研小组近年来在红曲方面的主要学术论文有:1、《红曲霉深层发酵法生产红曲红》,《中国食品添加剂》2001年第1期;2、《深层发酵用高色价红曲霉菌株的选育》,《2004东方红曲国际研讨会论文集》2004年。发明专利有:公开号103008A,专利号CN1030008。

(本文作者:东莞市天益生物工程有限公司总工室)

 
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